2024年12月11日水曜日

Catch Key Points of a Paper ~0213~

論文のタイトル: Mechanistic differences between linear vs. spirocyclic dialkyldiazirine probes for photoaffinity labeling(線形 vs. スピロ環状ジアルキルジアジリンプローブの光親和性標識における機構的差異)
著者: Jessica G. K. O'Brien, Louis P. Conway, Paramesh K. Ramaraj, Appaso M. Jadhav, Jun Jin, Jason K. Dutra, Parrish Evers, Shadi S. Masoud, Manuel Schupp, Iakovos Saridakis, Yong Chen, Nuno Maulide, John P. Pezacki, Christopher W. am Ende,* Christopher G. Parker* and Joseph M. Fox*
雑誌名: Chemical Science
巻: Volume 15, 15463-15473
出版年: 2024
DOI: https://doi.org/ 10.1039/d4sc04238g

背景

1: 光親和性標識とは?

  • 光親和性標識は、生細胞において、低分子リガンドとその標的との相互作用を調べるために広く使われている技術
  • 光親和性プローブは、リガンドを濃縮ハンドル(例:アルキンやビオチン)と光反応性基に結合させることで構築される
  • 光反応性基は、励起されると、近傍の標的を捕捉できる短寿命の反応性中間体を生成

2: 従来の光親和性プローブの課題

  • 古典的なベンゾフェノン、アリールアジド、アリールジアジリンに基づくプローブは、好ましい架橋速度を示しますが、その大きなサイズと疎水性のために、プローブの物理化学的特性が支配的になる
  • 理想的な光親和性プローブは、親プローブとほぼ同じ透過性と結合特性を示し、光分解時に高収率と非常に速い反応速度で標的と架橋し、それによって標的とインタラクトームの効果的なマッピングを可能にする

3: ジアルキルジアジリンの登場

  • 最小限のサイズと好ましい物理化学的特性を持つため、ジアルキルジアジリンは、細胞内相互作用の光親和性プローブとして台頭してきた
  • これらには、低分子とタンパク質の相互作用、薬物、天然物、フラグメント、タンパク質間相互作用、核酸とタンパク質の相互作用、代謝オリゴ糖工学、脂質とタンパク質の相互作用、生体膜の研究などが含まれる

方法

1: 研究デザイン

  • 線状ジアジリンとスピロ環状シクロブタンジアジリンの光化学的挙動の違いを、in vitroおよびin vivo実験を用いて調査

2: 化合物合成

  • メカニズム研究のための標準物質として、メチレンシクロプロパン、シクロブテン、ビシクロブタン、シクロブチルメチルエーテルのベンジルエステルおよびベンジルアミド類縁体を調製
  • アルキン官能基化スピロ環状ジアジリンに基づく一連のプローブを合成: N-(プロピニル)-1,2-ジアザスピロ[2.3]ヘキサ-1-エン-5-アミン および 5-プロピニル-1,2-ジアザスピロ[2.3]ヘキサ-1-エン-5-カルボン酸 

3: 光分解実験

  • シクロブタンジアジリン誘導体の光分解生成物を特性評価するために、様々な条件下で光分解実験を実施
  • メタノール (MeOH) 中でのジアジリンの光分解により、カルベン中間体の存在を示唆する生成物を得る

4: 生細胞標識実験

  • 線状ジアジリンとシクロブチルジアジリンに基づく一連のフラグメントプローブを用いて、生細胞における両者のプロテオミクスプロファイルを比較評価
  • HEK293T 細胞を様々な濃度のプローブ化合物で処理し、UV 照射を実施
  • 細胞を溶解し、タンパク質結合プローブを銅触媒アジド-アルキン 1,3-双極子環化付加反応によりテトラメチルローダミンに結合させる

結果

1: シクロブタンジアジリンの光分解によるカルベン生成の証拠

  • シクロブタンジアジリン誘導体の光分解により、メチレンシクロプロパンとシクロブテンが生成され、これはカルベン中間体の生成と一致する結果だった
  • テトラメチルエチレン (TME) 存在下でのシクロブタンジアジリンの光分解により、カルベン捕捉付加体が形成された
  • これらの結果は、シクロブタンジアジリンが光分解時にカルベン中間体を生成することを示唆

2: ジアゾシクロブタンの反応性

  • ジアゾシクロブタンは、水と急速に反応し、タンパク質アルキル化剤として機能することが明らかになった
  • ジアゾシクロブタンは、365 nm の光照射条件下ではシクロブチリデンへの有意な前駆体ではなかった

3: 生細胞における線状ジアジリンとシクロブタンジアジリンの標識効率の比較

  • シクロブチルジアジリンは、生細胞ケモプロテオミクス実験において、線状ジアルキルジアジリンと比較してタンパク質捕捉効率が低いことを示した
  • ゲルベースのプロファイリングと定量的 MS ベースのプロテオミクス解析により、シクロブタンジアジリンプローブで処理したサンプルでは、対応する線状ジアジリンプローブで処理したサンプルと比較して、標識が大幅に減少していることが明らかになった

考察

1: シクロブタンジアジリンの光化学

  • シクロブタンジアジリンの光分解は、線状ジアジリンとは異なり、カルベン化学が大きく寄与し、ジアゾ化学の寄与は少ないことを示している
  • メチレンシクロプロパン生成物の生成は、非ジアジリン前駆体から形成されたシクロブチリデンの初期の研究で観察されたように、カルベン機構が寄与していることを示唆している[ref1, 2, 3, 4, 5, 6]

2: ジアゾシクロブタンの役割

  • ジアゾシクロブタンは、シクロブタンジアジリンの光分解における重要な中間体ではないと考察
  • 線状ジアジリンは、タンパク質の標識にも関与する比較的長寿命のジアゾアルカンを生成する可能性がありますが、シクロブタンジアジリンはジアゾ生成物が最小限に抑えられ、標識は主にカルベン機構を介して行われる

3: 線状ジアジリンとシクロブタンジアジリンの標識プロファイルの違い

  • 線状ジアジリンは、ジアゾアルカン中間体を介した標識により、全体的な標識レベルが高くなる
  • シクロブタンジアジリンは、主にカルベン機構を介して標識するため、全体的な標識レベルは低くなりますが、バックグラウンド標識レベルも低くなる

結論

  • 線状ジアジリンとシクロブタンジアジリンの光化学的挙動の違いを明らかにした
  • シクロブタンジアジリンは、線状ジアジリンと比較して、カルベン化学への寄与が大きく、ジアゾ化学への寄与は少ないことが示された

将来の展望

  • この知見は、光親和性標識プローブの設計と応用に重要な意味を持つ
  • シクロブチリデン中間体の高い反応性と短寿命を考慮すると、シクロブタンジアジリンは、標識の半径が特に重要な考慮事項である低分子標的同定などのアプリケーションで特に役立つ

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